一、目的要求

1、掌握各種分離、接種方法。

2、掌握無菌操作基本環(huán)節(jié)。

二、實驗說明

微生物在自然界中呈混雜狀態(tài)存在，要獲得所需菌種，必需從中把它們分離出來。在保存菌種時不慎受到到污染也需予以分純。微生物分離和純化的方法很多，但基本原理卻是相似的，即將待分離的樣品進行一定的稀釋，并使微生物的細胞（或孢子）盡量以分散狀態(tài)存在，然后使其長成一個個純種單菌落。然而上述工作又離不開接種，即將一種微生物移到另一滅過菌的培養(yǎng)基上的過程。

三、實驗材料

1、恒溫培養(yǎng)箱。

2、接種環(huán)、玻璃棒、吸管、酒精燈。

3、培養(yǎng)基（上次實驗配制的）。

4、大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌。

四、方法步驟

（一）接種的操作

1、斜面接種（接金黃葡萄球菌）

（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精揮發(fā)后點燃酒精燈。

（2）將菌種管和斜面握在左手大姆指和其它四指之間，使斜面和有菌種的一面向上，并處于水平位置。

（3）先將菌種和斜面的棉塞旋轉(zhuǎn)一下，以便接種時便于拔出。

（4）左手拿接種環(huán)（如握鋼筆一樣），以火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管其余部位也過火滅菌。

（5）用右手的無名指、小指和手掌將菌種管和待接斜面試管的棉花塞或試管帽同時拔出，然后讓試管口緩緩過火滅菌（切勿燒過燙）。

（6）將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，接種環(huán)在試管內(nèi)壁或未長菌苔的培養(yǎng)基上接觸一下，讓其充分冷卻，然后輕輕刮取少許菌苔，再從菌種管內(nèi)抽出接種環(huán)。

（7）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面底部向上作“Z”形來回密集劃線。有時也可用接種針僅在培養(yǎng)基的中央拉一條線來作斜面接種，以便觀察菌種的生長特點。。

（7）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面底部向上作“Z”形來回密集劃線。有時也可用接種針僅在培養(yǎng)基的中央拉一條線來作斜面接種，以便觀察菌種的生長特點。

（8）接種完畢后抽出接種環(huán)灼燒管口，塞上棉塞。

（9）將接種環(huán)燒紅滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。

2、液體接種

（1）由斜面培養(yǎng)基接入液體培養(yǎng)基，此法用于觀察細菌的生長特性和生化反應(yīng)的測定，操作方法與前相同，但使試管口向上斜，以免培養(yǎng)液流出接入菌體后，使接種環(huán)和管內(nèi)壁磨擦幾下以利洗下環(huán)上菌體。接種后塞好棉塞將試管在手掌中輕輕敲打，使菌體充分分散。

（2）由液體培養(yǎng)基接種液體培養(yǎng)基，菌種是液體時，接處除用接種環(huán)外尚用無菌吸管或滴管。接種時只需在火焰旁拔出棉塞,將管口通過火焰,用無菌吸管吸取菌液注入培養(yǎng)液內(nèi),搖勻即可。

3、平板接種

將菌在平板上劃線和涂布。

（1）劃線接種 見分離劃線法。

（2）涂布接種 用無菌吸管吸取菌液注入平板后，用滅菌的玻棒在平板表面作均勻涂布。

4、穿刺接種

把菌種接種到固體深層培養(yǎng)基中，此法用于嫌氣性細菌接種或為鑒定細菌時觀察生理性能用。

（1）操作方法與上述相同，但所用的接種針應(yīng)挺直。

（2）將接種針自培養(yǎng)基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途徑慢慢拔出。

（二）分離的操作方法

1、稀釋分離法

通過不斷稀釋使被分離的樣品分散到zui低限度，然后吸取一定量注入平板與溫度適合溶化了的瓊脂培養(yǎng)基混合，這樣分散的細菌被固定在原處而形成單菌落。

（1）將大腸桿菌或酵母菌用無菌水制作菌懸液。

（2）取若干支無菌試管，每支內(nèi)盛9ml無菌水。

（3）吸取1ml制備好的菌懸液，置于*支含有9ml無菌水的試管內(nèi)，這樣就稀釋了10倍，也就是10^-2。

（4）從*支試管內(nèi)（10^-2）吸取1ml注入第二支含有無菌水的試管內(nèi)，這樣就稀釋了100倍，也就是10^-2。

（5）用同樣方法操作，直至稀釋至10^-5-10^-6。

（6）分別吸取10^-5-10^-6各稀釋度菌液0.2ml加入編好號的空無菌平皿中，同一稀釋度重復(fù)做三個平皿。

（7）將已溶化并冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基倒入上述各平皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使培養(yǎng)基與菌懸液充分混勻，凝固后倒置于37℃或38℃度恒溫箱中培養(yǎng)24-48小時，觀察平板上菌落生長和分布情況。

2、平板劃線分離法

平板劃線分離法是接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線而達到分離微生物的一種方法。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的。

（1）倒平板 溶化牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平板，水平靜置待凝。

（2）在酒精燈光焰上灼燒接種環(huán)，待冷，取一接種環(huán)金黃葡萄球菌、大腸桿菌混合菌液。

（3）左手握瓊脂平板稍抬起皿蓋，同時靠近火焰周圍，右手持接種環(huán)伸入皿內(nèi)，在平板上一個區(qū)域作之形回劃線，劃線時例接種環(huán)與平板表面成30-40°角度輕輕接觸，以腕力在表面作輕快的滑動，勿使平板表面劃破或嵌進增基內(nèi)。

（4）灼燒接種杯，以殺滅接種環(huán)上尚殘余的菌液，待冷卻后，再將接種環(huán)伸入皿內(nèi)，在*區(qū)域劃過線的地方稍接觸一下后，轉(zhuǎn)動90°，在第二區(qū)域繼續(xù)劃線。

（5）劃畢后再灼燒接種杯，冷卻后用同樣方法在其他區(qū)域劃線。

（6）全部劃線完畢后，在平皿底用特種蠟筆注明菌種、日期、組別、姓名。將整個培養(yǎng)皿倒置放入恒溫箱培養(yǎng)。

（7）37℃經(jīng)過24-48小時培養(yǎng)后取出觀察。注意菌落的開關(guān)、大小、顏色、邊緣、表面結(jié)構(gòu)、透明度等性狀。

附一 無菌操作環(huán)節(jié)

（1）接種室應(yīng)保持清潔，用煤粉酚皂液擦洗臺面及墻壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均應(yīng)用紫外燈滅菌。定期對接種室作無菌程度的檢查。

（2）進入接種室前，應(yīng)先做好個人衛(wèi)生工作，在緩沖間內(nèi)要更換工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只準(zhǔn)在接種室內(nèi)使用。不準(zhǔn)穿到其它地方去，并要定期更換、消毒。

（3）接種的試管、三角并瓶等應(yīng)做好標(biāo)記，注明培養(yǎng)基、菌種的名稱、日期。移入接種室內(nèi)的所有物品，均須在緩沖室用70%酒精擦試干凈。

（4）接種前，雙手用70%酒精或新潔爾消毒，操作過程不離開酒精燈火焰；棉塞不亂放；接種工具使用前后均需火焰滅菌。

（5）培養(yǎng)箱應(yīng)經(jīng)常清潔消毒。

附二 接種室的消毒方法

1、紫外線滅菌

接種室使用前打開紫外燈照射約30分鐘，就能使空氣和室壁表面基本上無菌。為了加強滅菌效果，在開燈以前可以在接種內(nèi)噴灑石炭酸溶液，使空氣中附有微生物的塵埃降落，并殺死一些微生物。接種室的臺面等，可以用2-3%的來蘇爾擦洗。

紫外線對人體皮膚，尤其對眼睛具有殺傷力，因皮不要直視開著的紫外燈，也不能在開著燈的情況下工作。

2、噴灑石炭酸

將石炭酸水浴，稍熱，使之溶解。用吸耳球通過吸管吸取該溶液，配成5%溶液。對于小房間，可用噴霧器由上至下、由里至外順序進行噴霧，并門，稍等片刻即可使用。石炭酸對皮膚有較強的毒害作用，使用時不要接觸皮膚。

3、福爾馬林熏蒸

（1）用量：市售福爾馬林是37-40%的甲醛水溶液。常用量按每立方空間2-6ml計算。

（2）熏蒸方法：用福爾馬林熏蒸有兩種方法：

①加熱熏蒸：按熏蒸空間計算,量取甲醛溶液,放在酒精燈上方的小鐵筒或燒杯中,點燃酒精燈,關(guān)閉室門。酒精燈在甲醛蒸完后即自行熄滅。

②氧化熏蒸：在一瓷杯里鋪一張報紙，放入高猛酸鉀（其用量為1/2甲醛量），再取定量的甲醛溶液，倒在盛有高猛酸鉀的容器里，立即關(guān)門。幾秒鐘后，由高猛酸鉀氧化甲醛反應(yīng)所產(chǎn)生的熱將其余的甲醛蒸為氣體。

由于甲醛對人眼、鼻有強烈的刺激作用，熏蒸后相當(dāng)時間內(nèi)不能進入室內(nèi)工作。因此，接種室至少在使用前24小時進行熏蒸，房間應(yīng)密閉，保持12小時。之后可取與甲醛等更是的氨水，倒在一個瓷碗里，放入熏蒸過的接種室，以減少甲醛對人的刺激作用。用氨水中和，至少應(yīng)在工作前2小時進行。

4、過濾除菌

近幾年來，多采用一種稱之為超凈工作臺的接種室，其原理是借助于一鼓風(fēng)機將普通空氣鼓入，通過粗濾、超濾纖維過濾后，進入工作臺內(nèi)的空氣即為無菌空氣。整個工作室內(nèi)要求清潔無塵，這樣可延長超凈工作臺的使用壽命。

新的超凈工作臺使用前，要進行無菌試驗，確定合格方可使用，接種前，應(yīng)先將工作臺開啟5-6分鐘。

附三 接種室無菌程度檢查

取無菌的營養(yǎng)瓊脂平板，在接種室內(nèi)臺上和臺下各放一套，把皿蓋打開15min，然后蓋好，倒置37℃恒溫培養(yǎng)24-28小時，如果每個皿內(nèi)菌落不超過4個，則可以認為無菌程度良好，若菌落很多，則應(yīng)對接種室進一步滅菌。